全自动蛋白定量分析仪器-Wes最新应用文献分享

发布时间:2019-03-06 14:22

自从2014年全自动蛋白免疫印迹系统-Wes面世,随后几年间Protein Simple将应用于全自动蛋白定量的系列仪器逐步融入市场,宣告蛋白质研究已经迈入了后定量时代。

The Next Generation is Simple Western!

    

      纵观科技发展征程,在科研乃至整个技术领域,仪器取代人工,往往都意味着里程碑式的进展。今日咱们抛开技术突破的价值描述不谈,一线科研人员更关心的必然是这项技术在日常工作中到底有什么实际帮助,又有什么值得称羡的特点。各位看官不用着急,且听小编结合科技发展风向标-2019收录的近两年最新文献,一一道来。


Part 1 全自动化,精准高效


      众所周知,传统Western blot技术1979年在巴塞尔研究所初现雏形,历经整整40年的发展,时至今日仍旧累于繁琐的实验步骤,严重依赖实验人员的操作水平,对实验结果的稳定性造成很大的障碍。

Western blot Each step introduces an opportunity for error!

      ProteinSimple旗下Simple Western系列产品实现了全自动蛋白定量,仅在前期需要实验人员准备试剂和样本,30min加样完毕,一键启动,2.5h即可得到实验数据,仪器取代人工,避免人工误差干扰,省时省力,精准高效。



应用案例一:快速应对急性传染病挑战
      埃博拉病毒是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热的烈性病毒,其引起的埃博拉出血热(EBHF)是当今世界上最致命的病毒性出血热。2014年在几内亚、利比里亚等国爆发的埃博拉病毒给西非各国造成了巨大的威胁。接种疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措施。应对这些急性传染病,我们需要快速研究出有效的疫苗。

      如能及时获知致病菌针对人体的攻击表位,就可以针对性的研发疫苗。来自美国陆军传染病医学研究所(USAMRIID)的研究人员开发了一种读码框可编辑的噬菌体表位展示系统。他们在丝状病毒感染的动物模型中,利用Wes测试了这个系统,结果证实此噬菌体表位展示系统可有效显示被感染动物血清抗体针对的免疫表位。

文献来源:Sanchez-Lockhart, M., D. S. Reyes, J. C. etl (2018). "Qualitative Profiling of the Humoral Immune Response Elicited by rVSV-DeltaG-EBOV-GP Using a Systems Serology Assay, Domain Programmable Arrays." Cell Reports 24(4): 1050-1059 e1055.

应用案例2:Wes在PD-L1免疫疗法研究中的应用

      肿瘤PD-L1的表达是一种潜在反应疗效的生物标志物,阻断程序性死亡配体-1(PD-L1)与程序性死亡-1(PD-1)受体的相互作用等抑制性检查点,可有效地抑制肿瘤细胞的免疫逃逸,但其调控的复杂机制尚不完全清楚。


      法国国家健康与医学研究院, 巴黎-萨克雷大学, 巴黎文理研究大学等机构的科学家,联合在最新一期Nature Medicine发表文章,发现黑色素瘤免疫逃逸新机制,Translational control of tumor immune escape via the eIF4F–STAT1–PD-L1 axis in melanoma,作者发现真核翻译起始复合物eIF4F结合了mRNAs的5‘端,通过调节信号转导子和转录激活因子1(STAT 1)转录因子的翻译,调节干扰素-γ诱导的PD-L1在癌细胞表面的表达。eIF4F复合物的形成与人黑色素瘤免疫治疗的反应相关。eIF4F的RNA解旋酶组分eIF4A具有较强的抗肿瘤免疫调节作用。因此,作为抗癌药物的eIF4A抑制剂也可能作为癌症免疫疗法新的候选药物。

文献来源:Translational control of tumor immune escape via the eIF4F–STAT1–PD-L1 axis in melanoma. 2018 Nature Medicine.


应用案例3 Wes用于定量检测运动员尿液兴奋剂方法开发

       促红细胞生物药物ESAs被严禁在体育运动赛事中使用,传统western blot,毛细管电泳,SDS-page电泳等技术已经在兴奋剂检测中广泛使用。但是这些方法,需过多手工操作,通量低,不能准确定量,无法实现对兴奋剂的大规模定量检测。由Protein Simple开发的毛细管电泳系统可用于此目的。这个平台是全自动的,可以很容易地实现。

       加拿大阿曼德-弗雷皮尔研究所(INRS-Institut Armand-Frappier)的研究人员最近基于ProteinSimple毛细管电泳Western Blot技术(Simple Western)开发超敏,快速,精准,定量,高特异性的尿液和血液兴奋剂检测方法。结果发表在最新一期,Drug Test Anal. 2018 Oct 26. doi: 10.1002/dta.2528.

文献来源:Detection of recombinant erythropoietins in urine samples using a capillary Western system. Drug Test Anal. 2018


Part 2  微量样本同样适用


应用案例1:应用Wes完成2000个分选骨髓干细胞western blot

       一只转基因小鼠大约20-500美元不等,利用转基因小鼠我们可以分离股骨骨髓或者干细胞,其得率约为7000分之一,也就是说一只小鼠可得1000个干细胞,一次传统WB需要5万个细胞,也就是50只小鼠,相当于每个泳道花费1000-25000美元,然而SW只需3微升,相当于3000个细胞,3只小鼠,相当于花费节省了约94%。


       2018年12月11日首都医科大学附属潞河医院内分泌中心,糖尿病防治北京市重点实验室的科学家,在Stem Cell发表最新干细胞研究成果,其中应用Wes完成了2000个分选骨髓干细胞的western blot检测。

文献来源:The impact of integrin β2 on granulocyte/macrophage progenitor proliferation.

STEM CELLS 2018

应用案例2:激光捕获显微切割样品(LCM)微量检测

       组织中包含有多种不同的细胞,这些细胞对外部刺激的响应不同,细胞异质性使得结果产生偏差。LCM激光捕获显微切割通过分离单一的细胞类型获得均质样品进而避免了这种偏差,但是LCM获得的样本量较少,蛋白质水平的研究受到很大限制,传统Western blot方法做相关的分析则需要20微升的LCM样品,对前期样本的累积获取和后续实验的可行性造成困难。本文利用WES对1微升LCM样品中的肌球蛋白重链MHC7蛋白顺利进行检测,大大提升实验效率。

应用案例3:膜蛋白无障碍定量

       以下案例收集自美国内达华大学的一位教授,对我们Simplewestern技术的高度认可和评价,他们利用传统WB做了近三年都没有得到有用的结果,而利用WES,1微克的鼠膀胱平滑肌细胞裂解物即可检测到膜蛋白TRPV4,短短几个月便得到了有效的实验数据。

 

Part 3  2-440kDa分子量大小蛋白质无忧检测


      Wes相较于传统western blot,拥有更宽的分子量检测范围。目前有三种试剂盒规格可供选择:2-40kDa;12-230kDa;66-440kDa,基本覆盖绝大多数靶蛋白分子量范畴


应用案例1:DMD患者中分子标志物dystrophin(427kDa)检测


      杜氏肌营养不良症(DMD)是一种神经性肌肉疾病,其特征在于骨骼肌和心肌的持续性衰弱。这种X染色体相关的疾病是由DMD基因中的开放阅读框突变引起的,最终导致抗肌肉萎缩蛋白的强烈减少或完全缺失。为了把抗肌肉萎缩蛋白作为临床诊断生物标志物,在治疗前后对DMD患者的肌肉组织中的抗肌肉萎缩蛋白进行定量分析至关重要。基因外显子删除和恢复的基因编辑方法,被认为是一项可实施的治疗手段。


       哈佛大学干细胞及生殖医学系Amy J. Wagers教授研究组,在Science上发表文章,使用(CRISPR)–Cas9编辑技术进行细胞系及小鼠注射基因编辑,发现可以有效逆转,恢复肌纤维基本功能。Simple Western被用于检测DMD基因编码产物-分子量高达427kD的肌萎缩蛋白dystrophin,上图显示在实验小鼠不同骨骼肌组织中(腹肌,四头肌,肱三头肌,腓肠肌)的基因编辑效果,即肌萎缩蛋白的表达量,vinculin黏着斑蛋白作为内参蛋白用于归一化。

文献来源:In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.  Science 351(6271): 407-411.


应用案例2:用于干燥症治疗中紧密连接蛋白claudin-5 (23kDa) 检测

       Sjögren综合征(SS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病,引起外分泌腺的分泌功能障碍,特别是在唾液腺和泪腺中,导致口干症和干眼症,严重影响生活质量。淋巴细胞浸润到外分泌腺中,作为SS发病机制中最重要的机制之一,导致进行性炎症进一步损害腺体,然而,导致淋巴细胞浸润的因素仍未阐明。内皮紧密连接(endotight junction, TJs)在血管的流涎和屏障功能中起着至关重要的作用,内皮屏障功能受TJ复合物调节,而claudin-5是唾液腺内皮细胞表达的特异性跨膜紧密连接蛋白。

      本文作者通过一系列的研究发现淋巴细胞之所以能够浸入到外分泌腺的腺体中主要是因为,内皮屏障功能遭到破坏,内皮屏障功能遭到破坏的原因主要是内皮细胞中claudin-5这个紧密连接蛋白的表达和分布出现了差异,从相邻内皮细胞的顶端部分重新定位到侧膜和细胞质中,从而使细胞之间的连接没有那么紧密了打破了内皮屏障功能使得,淋巴细胞能够进入外分泌腺体中引起炎症反应。claudin-5分子量23kd,表达量低,传统western blot难以检测,wes上样量3ul(实际进样量8ng)也能检测到claudin-5的表达差异。Wes在这种低微量小分子量蛋白的检测上具有无与伦比的优势。

文献来源:Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren‘s syndrome, Molecular Basis of Disease.(2018)


应用案例3:Wes在PGD1介导的类囊体膜重构中的应用-全膜结果

       Plant Cell是美国植物生物学家学会出版的生命科学领域学术刊物,在SCI植物类非评论性杂志中排名第一。最近,Plant Cell发表了美国能源部植物研究实验室的文章,使用Wes定量western blot技术研究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)环境应力下类囊体膜重构。


样本:莱茵衣藻样品使用2X Laemmli buffer提取
背景:在植物和藻类中,嵌入在极性脂基质中的光合复合物构成了光合作用所必需的类囊体膜的基本结构。为了检验这种可能性,我们进行了定量毛细管电泳和免疫检测(定量western blot技术)。

文献来源:Galactoglycerolipid Lipase PGD1 Is Involved in Thylakoid Membrane Remodeling in Response to Adverse Environmental Conditions in Chlamydomonas. Plant Cell  ( 2018 )



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